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产品名称:rAAV基因抑制表达技术服务(ZC5000-3)

货号 规格 价格 订购数量 是否现货
ZC5000-3 货期4周 20 x 50μl 询价 - + 有货

包装容量大,最高可容纳7kb外源DNA片段

低吸附医用包装材料配合专业产品稀释液,降低产品二次损耗


腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)为微小病毒科 (Parvovirus)依赖病毒属(Subvirus)的单链线状DNA病毒,无包膜,基因组约4700bp,衣壳蛋白呈20面体立体对称,病毒颗粒的直径在20-26nm之间。根据衣壳的差异,目前AAV可分为13种血清型(AAV1~AAV13)和100多种变异体,可感染不同组织的细胞。

重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)具有免疫原性低、转染效率高、表达时效长的特点,是进行外源基因转导和表达研究的优良载体,也是目前唯一获得欧盟委员会(EC)认证上市的基因治疗药物Glybera所使用的载体。本公司生产的重组腺相关病毒采用最为安全和经典的三质粒共转染技术,不需辅助病毒,产品具有独特的安全性、可靠性和稳定性,特别适合对基因治疗载体要求高的临床前或临床试验。


■ 技术服务内容

1.服务类型:

rAAV-基因抑制表达


2.服务内容:

客户可根据需要提供基因及启动子信息,选择不同的血清型、单双链、病毒滴度、纯化级别等,具体内容见下表:

选择项目

基因抑制表达系列

可选血清型

1-13/DJ

/双链

/

启动子

任意常见小RNA启动子

基因

任意常见功能小RNA

需客户提供

启动子和功能小RNA序列

规格

总量>=1012 vg,病毒滴度客户可自选,分装规格客户自定

纯化级别

粗提液/80%纯度/90%纯度/95%纯度/99%纯度,客户自选


3.服务流程:



4.服务优势:

(1)包装容量大:最高可容纳7Kb外源DNA片段,打破rAAV载体包装容量小,最多只能容纳4.7kb外源DNA片段的限制。

(2)稳定性高:低吸附医用包装材料配合专业产品稀释液,降低产品二次损耗。产品-80℃质保期6个月(物理滴度下降<10%)。

(3)超高滴度:可定制高于1016vg/ml超高滴度产品,非常适合大批量试验。

(4)超高纯度:可定制高于99%的超高纯度产品,完全满足临床试验需求。

(5)血清型全:可生产AVV1-AVV12、DJ现有所有主流血清型。

(6)活性高:细胞水平最低转染滴度仅需103vg/cell,动物系统给药最低只需1011vg/kg。

(7)内毒素低:内毒含量<5eu,可定制。

(8)单双链齐全:所有血清型均可生产单双链产品。

(9)产品完全定制化:产品所有元件都可以根据客户需求进行定制。

(10)质控齐全:GLP中试环境,可实现高达15项产品质控,满足不同的实验需求。


5. 部分质控展示:

(1)产品衣壳鉴定(必做):

采用SDS-PAGE,Western blot方法进行rAVV的初步表征与鉴定。通过 VP1、VP2、VP3蛋白的含量及其比例(VP1:VP2:VP3约为1:1:10)来鉴定产品是否为经典rAAV。



(2)纯度质控:

①银染法(必做):采用SDS-PAGE,银染法可以进一步分析rAVV的VP1,VP2 和VP3的蛋白总量和总蛋白的比例,分析rAVV的纯度。



②HPLC分析(可选):液相色谱是病毒分离纯化的重要方法,同时也是病毒纯度检测的一种形式。高纯度的rAAV可以看到一个清晰的高而尖锐的洗脱峰,不见其他杂峰,否则杂质较多。



(3)滴度质控(必做):

通过qPCR的方法检测rAAV基因组的拷贝数并同标准样品相比较来确定病毒滴度,滴度单位为vg/mL。如下图所示,既能显示对于产品的病毒滴度,同时也体现了公司滴度测试体系的可靠性与稳定性。




(4)内毒素质控(可选):

公司采用成熟的绝对标准曲线法进行内毒素检测


(5)活性检测(可选):

测试目的基因导入受体细胞后,能表达并能达到治疗效果。下图分别为产品感染NCIH446和HEK293细胞的测试图。

产品感染NCIH446测试细胞(MOI:1E+4)

产品感染HEK293测试细胞(MOI:1E+4)


■ 附注

1.血清型选择:

血清型

组织亲和性

AVV1

肌肉、心脏、骨骼(包括心肌)、神经组织

AVV2

中枢神经、肌肉、肝脏、脑组织、眼

AVV3

肌肉、肝脏、肺、眼

AVV4

中枢神经、肌肉、眼、脑

AVV5

肺、眼、中枢神经、关节滑膜、胰腺

AVV6

肺、心脏

AVV7

肌肉、肝脏

AVV8

肝脏、眼、中枢神经、肌肉

AVV9

心脏、肌肉、肺(肺泡)、肝脏、中枢神经

DJ

肝脏、视网膜、肺、肾脏


2.常见启动子选择:

(1)CAG:广泛的通用启动子

(2)CMV:优化的高效通用启动子

(3)CB:截短型通用启动子

(4)EF1a广泛的通用启动子

(5)SYN:神经元细胞特异性启动子

(6)CaMKII:海马体特异性神经元细胞特异启动子

(7)GFAP:星形胶质细胞特异启动子


3.不同病毒的生物学特性比较

项目

慢病毒

逆转录病毒

腺相关病毒

腺病毒

包膜

颗粒直径

90-100 nm

90-100 nm

20-30 nm

60-90nm

基因组

dsRNA

dsRNA

ssDNA

dsDNA

免疫原性

中免疫原性

中免疫原性

低免疫原性

高免疫原性

表达起始时间

48-72h

48-72h

12-96h

24-48h

表达持续时间

> 2 months

> 2 months

> 6 months

< 1 month

表达丰度

高水平表达

非分裂细胞表达极低

高水平表达

高水平表达

整合方式

随机高频整合

随机高频整合

定向低频整合

非整合


4.不同AAV血清型对相同的组织和细胞具有不同的感染效率

Cell Line

AAV-1

AAV-2

AAV-3

AAV-4

AAV-5

AAV-6

AAV-8

AAV-9

AAV-DJ

Huh-7

13

100

2.5

0.0

0.1

10

0.7

0.0

500

HEK293

25

100

2.5

0.1

0.1

5

0.7

0.1

500

HeLa

3

100

2.0

0.1

6.7

1

0.2

0.1

667

HepG2

3

100

16.7

0.3

1.7

5

0.3

ND

1250

Hep1A

20

100

0.2

1.0

0.1

1

0.2

0.0

400

911

17

100

11

0.2

0.1

17

0.1

ND

500

CHO

100

100

14

1.4

333

50

10

1.0

25000

COS

33

100

33

3.3

5.0

14

2.0

0.5

500

MeWo

10

100

20

0.3

6.7

10

1.0

0.2

2857

NIH3T3

10

100

2.9

2.9

0.3

10

0.3

ND

500

A549

14

100

20

ND

0.5

10

0.5

0.1

1000

HT1180

20

100

10

0.1

0.3

33

0.5

0.1

333

Monocytes

1111

100

ND

ND

125

1429

ND

ND

100

Immature DC

2500

100

ND

ND

222

2857

ND

ND

200

Mature DC

2222

100

ND

ND

333

3333

ND

ND

100








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